Картирование генов. Принципы генетического картирования

Картирование основополагающих паттернов городской жизни Для того чтобы понять природу городов как живых систем (и тем самым их фрактальную, голографическую и морфическую природу), мы должны рассмотреть четыре основополагающих карты городской жизни:? четырёхсекторную

Определение понятия «картирование идей»

Определение понятия «картирование идей» «Ментальная карта использует весь диапазон способностей коры головного мозга с применением слов, изображений, чисел, логики, ритма, цвета, а также пространственных отношений в единственной, уникально мощной технике. Благодаря

Препятствие 10: картирование идей в режиме реального времени

Препятствие 10: картирование идей в режиме реального времени Препятствие 10: «Я попытался картировать идеи во время трехчасового доклада. Я не мог определить, к чему ведет выступающий, и моя карта стала беспорядочной. Через 20 минут я сдался и снова принялся делать линейные

Глава 9 Командное картирование

Глава 9 Командное картирование Одним из самых живых и нервных видов моей работы является инструктирование команд в процессе создания, совместного использования и объединения их идей по конкретному вопросу и определения приоритетности поставленных задач. Этот вид

Индивидуальное картирование

Индивидуальное картирование Как только тема определена, каждый участник самостоятельно картирует свои идеи, где фиксирует все свои мысли на заданную тему. В случае проведения занятия по годовому стратегическому планированию я прошу участников фиксировать их мысли,

Картирование семинара в режиме реального времени – Лэндмарк форум

Картирование семинара в режиме реального времени – Лэндмарк форум Чун Бу Лим занимал многие руководящие посты, а на данный момент является ведущим преподавателем Нджи Энн Политекник в Сингапуре. Он использует технику картирования идей с 2006 года и великолепно овладел

Глава 13 Заключительное задание: картирование идей в режиме реального времени

Глава 13 Заключительное задание: картирование идей в режиме реального времени В этой главе мы рассмотрим: определение картирования идей в режиме реального времени; пять ключевых моментов для успешного картирования идей в режиме реального

Картирование коррупционных рисков и возможностей

Картирование коррупционных рисков и возможностей Коррупция проникает в таможенные органы множеством путей. Одним из крайних вариантов является политическая приватизация таможенной системы в целом, которая превращает таможню в инструмент политической элиты для

Генетические карты хромосом - это схема взаимного расположения и относительных расстояний между генами определенныххромосом, находящихся в одной группе сцепления.

Впервые в 1913 - 1915 годах на возможность построения генетических карт хромосом указывают Т. Морган и его сотрудники. Они экспериментально показали, что основываясь на явлениях сцепления генов и кроссинговера можно построить генетические карты хромосом . Возможность картирования основана на постоянстве процента кроссинговера между определенными генами. Генетические карты хромосом составлены для многих видов организмов: насекомых (дрозофила, комар, таракан и др.), грибов (дрожжи, аспергилл), для бактерий и вирусов.

Генетические карты человека используются в медицине при диагностике ряда тяжелых наследственных заболеваний человека. В исследованиях эволюционного процесса сравнивают генетические карты разных видов живых организмов. Помимо генетических, существуют и другие карты хромосом.

Физическая карта – графическое представление порядка следования физических маркеров (фрагментов молекулы ДНК), расстояние между которыми определяется в парах нуклеотидов.

Рестрикционная карта – вид физической карты, на которой указан порядок следования и расстояния между сайтами расщепления ДНК рестриктазами (обычно участок узнавания рестриктазы 4-6 п.н.). Маркерами этой карты являются рестрикционные фрагменты/сайты рестрикции.

Картирование хромосом- Определение положения данного гена на какой-либо хромосоме относительно других генов. Используют три основные группы методов картирования генов – физическое (определение с помощью рестрикционных карт, электронной микроскопии и некоторых вариантов электрофореза межгенных расстояний – в нуклеотидах), генетическое (определение частот рекомбинаций между генами, в частности, в семейном анализе и др.) и цитогенетическое (гибридизации in situ, получение монохромосомных клеточных гибридов, делеционный метод и др.). В генетике человека приняты 4 степени надежности локализации данного гена – подтвержденная (установлена в двух и более независимых лабораториях или на материале двух и более независимых тест-объектов), предварительная (1 лаборатория или 1 анализируемая семья), противоречивая (несовпадение данных разных исследователей), сомнительная (не уточненные окончательно данные одной лаборатории).

На сегодняшний день не существует четкой классификации методов картирования. Так, например, одни авторы относят цитогенетические методы (FISH, PRINS и т.п.) к генетическим методам, другие к физическим. Однако, следует помнить, что по сути все методы являются генетическими, так как конечный результат картирования - получение максимально подробной карты взаимного расположения структурных, функциональных и полиморфных последовательностей генома и определение расстояний между ними. Поэтому разделение методов картирования на генетические, цитогенетические и физические, предложенное в этой статье, основано исключительно на методических подходах, используемых для построения генетических карт.

Генетическое картирование - это картирование, основанное на методах классической генетики - определении групп сцепления, частоты рекомбинации и построении генетических карт, где единицей измерения служат проценты рекомбинации, или сантиморганы (сМ). Цитогенетическое картированиефизическое картирование - это обширная группа методов, позволяющая строить карты генома (обычно их называют физическими) высокого уровня разрешения и определять расстояния между локализуемыми нуклеотидными последовательностями с точностью от нескольких десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары. осуществляется с применением методов цитогенетики, когда для локализации каких-либо нуклеотидных последовательностей и определения их взаимного расположения используются цитологические препараты. И, наконец,

Стратегические подходы к картированию геномов

В настоящее время выделяют три основных подхода к картированию геномов, различающихся временем появления, необходимой методической базой и спектром возможностей: функциональный, кандидатный и позиционный (рис. 1).

Вплоть до последнего времени в картировании доминировал функциональный подход, основанный на априорном наличии некоторой информации о биохимическом полиморфизме, лежащем в основе того или иного наследственного признака. Методически такое картирование начинается с выделения в чистом виде белкового продукта гена. Далее к нему по аминокислотной последовательности подбирают вырожденные праймеры и проводят ПЦР-скрининг геномных библиотек. Однако список генов, для которых эта информация была достаточно полной к настоящему времени практически исчерпан и большинство генов, функция которых была известна, уже клонированы и локализованы.

Близко к функциональному и кандидатное картирование. В этом случае информация о функциональном изменении недостаточно полна, чтобы точно указать ген, однако достаточна для того, чтобы выдвинуть более или менее обоснованные предположения о возможных кандидатах либо по их функции, либо по положению на хромосоме. Важно подчеркнуть, что и при функциональном, и при кандидатном подходе клонирование гена, как правило, предшествует его точной локализации в геноме, т.е. картированию. В рамках этих подходов локализовать ген означало пройти путь от его функции к локализации на хромосоме (позиции). Такой путь принято считать выражением стратегии "прямой генетики", он характерен и для традиционных методов генетического и цитогенетического картирования. До недавнего времени другой путь был практически невозможен.

Появление в конце 80-х годов множества высокополиморфных ДНК-маркеров дало возможность пойти в обратном направлении - от хромосомной карты к функции. Стратегия "обратной генетики", применительно к поиску генов, получила воплощение в позиционном картировании, которое подразумевает локализацию гена при отсутствии всякой функциональной информации о нем. При этом его место на карте устанавливают по результатам анализа сцепления гена с ранее локализоваными генетическими маркерами и далее детально исследуется уже область генома рядом с маркером.

Главным ограничением позиционного подхода является низкая разрешающая способность генетических карт - интервал между двумя соседними маркерами, в котором локализован ген, может оказаться слишком велик и недоступен физическому картированию.

Для большинства генов, которые были локализованы, характерны структурные аномалии (как правило, это гены, ответственные за наследственные заболевания человека), что существенно облегчает заключительную стадию поиска гена - выделение и локализацию гена.

Способом, который позволяет преодолеть ограничения позиционного картирования, является объединение стратегии "обратной генетики" с преимуществами кандидатного подхода. Такой способ картирования, называемый позиционно-кандидатным, постепенно приходит на смену позиционному и заключается в поиске на выявленном участке генома подходящих кандидатных генов.

Похожая информация.

Генетические карты сцепления. Генетические карты сцепления определяют хромосомную принадлежность и взаимное расположение генетических маркеров относительно друг друга. Картирование в узком смысле -- определение положения гена или мутации в хромосоме. Позднее этот термин получил более широкое толкование. Он относится не только к гену, но к любому маркеру, под которым подразумевают ген, мутацию, участок ДНК с неопределенной функцией, точку расщепления ДНК рестриктазами. Таким образом, маркер -- это любой наследуемый признак, доступный идентификации тем или иным способом. Установление локализации какого-либо маркера позволяет использовать его для определения положения другого маркера.

На практике именно генетические карты сцепления и только они позволяют локализовать сложные генетические маркеры (например, ассоциированные с симптомами заболевания) на первых этапах исследования и дают возможность их дальнейшего изучения.

До начала 70-х годов XX в. построение генетических карт человека продвигалось очень медленными темпами. Первый ген человека (ген цветной слепоты) был картирован на Х-хромосоме в 1911 г., а первый аутосомный ген -- только в 1968 г. К 1973 г. на хромосомах человека было картировано 64 гена, а к 1994 г. -- 5000 структурных генов и свыше 60 000 маркерных ДНК-последовательностей. Столь стремительный прогресс в картировании генов человека связан с появлением новых технологий в цитогенети-ке, в клеточных культурах и особенно в молекулярной генетике.

Гибридизация соматических клеток. Одним из наиболее популярных методов отнесения генетического маркера (функционально активного гена) к конкретной группе сцепления является гибридизация (слияние друг с другом) соматических клеток разных биологических видов организмов, один из которых -- исследуемый. Гибридные клоны получают путем искусственного слияния клеток человека и различных грызунов: китайского хомячка, мыши, крысы. Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось, сопровождается утратой хромосом человека. Потеря хромосом носит случайный характер, и образующиеся клоны клеток содержат оставшиеся хромосомы в разных сочетаниях. Так получают панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну или несколько хромосом человека и полный набор хромосом другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфических мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах позволяет однозначно определить хромосомную принадлежность соответствующих генов.

Гибридизация in situ (в том же месте). Этот метод дает возможность локализовать определенные последовательности нуклеотидов на хромосомах. Они выступают в качестве зондов. Препараты фиксированных хромосом гибридизуют с исследуемыми последовательностями, меченными радиоактивной или флуоресцентной меткой. Меченые молекулы оказываются ассоциированными с участками хромосом, содержащими последовательности, комплементарные меченому зонду. Полученные гибриды анализируют с помощью микроскопа либо непосредственно, либо после радиоавтографии. Этот метод по частоте использования в последнее время прочно выходит на первое место. Наиболее популярной оказалась группа методов, получивших название флуоресцентной гибридизации in situ -- метод FISH (от англ. Fluorescence in situ hybridization ).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволила быстро и эффективно амплифицировать почти любой участок генома человека, а полученные продукты ПЦР использовать в качестве зондов для картирования соответствующих участков на хромосомах путем гибридизации in situ . В этом плане успешно разработана концепция сайтов, привязанных к последовательностям, --STS (от англ. Sequence-tagged sites). Все фрагменты ДНК, которые используются для построения генетических и физических карт, можно однозначно идентифицировать с помощью последовательности нуклеотидов длиной в 200 -- 500 н.п., которая является уникальной для данного фрагмента. Эти сайты амплифицируют с помощью ПЦР и применяют в качестве зондов. STS позволили создать основу для разработки единого языка, дающего возможность разным лабораториям описать свои клоны. Конечным результатом разработки концепции STS является создание исчерпывающей карты STS генома человека. Для получения маркеров в настоящее время часто применяют праймеры, соответствующие диспергированным повторяющимся последовательностям, среди которых первыми стали использовать А1u-последовательности, так как они характерны именно для генома человека. Поскольку в геноме человека больше 90 % умеренно повторяющихся последовательностей представлены семействами А1u и Крn I (последние повторяются реже и обладают характерной локализацией в хромосомах), они и используются для получения соответствующих зондов в ПЦР-реакции.

Физические карты низкого разрешения. Физические карты генома отражают реальное расстояние между маркерами, выражаемое в парах нуклеотидов. Физическую карту низкого разрешения часто называют хромосомной (цитогенетической) картой генома.

В начале 70-х годов XX в. появилась реальная возможность точной идентификации не только всех хромосом в кариотипе человека, но и их отдельных сегментов. Это связано с появлением мето да дифференциального окрашивания препаратов метафазных хромосом. Хромосомные препараты окрашивают некоторыми флуорохромами после соответствующей протеолитической обработки или нагревания. При этом на хромосомах выявляется характерная поперечная исчерченность -- так называемые диски (бэнды), расположение которых специфично для каждой хромосомы. Величина небольших дисков на прометафазных хромосомах соответствует примерно 1 млн н.п. на физических картах. Каждая хромосома после дифференциальной окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых начинается от центромерного района вверх (короткое плечо р) либо вниз (длинное плечо -- q) . Полосы в каждом сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Запись положения гена на карте включает номер хромосомы, плечо, номер сегмента, бэнда и его субъединицы.

Запись 7 q21.1 означает, что ген локализован в субъединице 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча хромосомы 7. Подобная запись удобна для цитогенетического картирования метода гибридизации in situ, позволяющего локализовать ген с точностью до одного бэнда и даже его субъединицы.

Хромосомные карты генома человека получают также локализацией генетических маркеров, чаще всего методом FISН: для метафазных хромосом разрешающая способность хромосомных карт находится в пределах 2 -- 5 млн н.п.; для интерфазных хромосом (генетический материал находится в менее компактной форме) -- приближается к 100 тыс. н.п. Для этого уровня картирования характерны карты кДНК (с. 358). Они отражают положение экспрес-сирующихся участков ДНК (экзонов) относительно известных ци-тогенетических маркеров (бэндов) на метафазных хромосомах. Поскольку такие карты дают представление о локализации транскрибирующихся участков генома, в том числе и генов с неизвестными функциями, они могут быть использованы для поиска новых генов. Этот подход полезен при поиске генов, повреждение которых вызывает заболевания человека, в том случае, если приблизительная локализация таких участков хромосом уже проведена на генетических картах сцепления (см. рис. 100).

Физические карты высокого разрешения. Для построения физических карт высокого разрешения экспериментально реализуется два альтернативных подхода: картирование сверху вниз и картирование снизу вверх (рис.В к геному) . Для картирования сверху вниз препарат ДНК индивидуальной хромосомы человека разрезают крупнощепящими рестриктазами (например, Not I) на длинные фрагменты, которые после разделения методом электрофореза в пульсирующем поле подвергаются дальнейшей обработке другими рестриктазами.

Методом электрофореза под действием однонаправленного постоянного поля в агарозном или полиакриламидном гелях удается разделить фрагменты ДНК размером не более 30 --50 тыс. н.п. Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем изменении направления электрического поля происходит за счет конформационных изменений, обусловленных скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переключения направления поля. В этом случае удается разделить молекулы ДНК размером от 50 тыс. н.п. до 10 млн н.п.).

В результате получают макрорестрикционную карту. Метод электрофореза был с успехом использован для картирования малых геномов.

Для картирования генома человека снизу вверх на основе препарата суммарной ДНК генома или индивидуальной хромосомы получают серию случайных клонов протяженных последовательностей ДНК (10-- 1000 тыс. н.п.), часть из которых перекрывается друг с другом. В качестве вектора для клонирования в этом случае используют искусственные минихромосомы дрожжей (УАС). Последовательный набор клонов, содержащих частично перекрывающиеся и дополняющие друг друга фрагменты ДНК из определенного района генома, получил название скользящего зондирования, или «прогулки по хромосоме». Каждый раз отобранный фрагмент используется в качестве ДНК-зонда для последующего поиска. В результате получают набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих исследуемый участок генома, получивший название «контиг». Эта стратегия впервые была успешно применена для изучения 3-й хромосомы дрозофилы. С ее помощью редко удается пройти более 200 -- 300 тыс. н.п. в одном направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей ДНК. Для преодоления таких ограничений и ускорения процесса поиска генных последовательностей Ф. Коллинз, ныне президент Международного консорциума, предложил метод «прыжков» по хромосоме, позволяющий изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в геноме друг от друга на сотни тысяч пар нуклеотидов (длина прыжка), не выделяя при этом все промежуточные последовательности ДНК.

Правильность полученных контигов подтверждают обычно гибридизацией in situ (FISH) с одновременной привязкой к определенным участкам исследуемых хромосом.

1.1. При цитологическом картировании изучение дифференциально окрашенных хромосом позволяет обнаружить крупные хромосомные перестройки путем сравнения исследуемого образца с контрольным.

1.1.1. Гибридизация in situ: ISH- и FISH- гибридизация

Прямым методом картирования генов на хромосоме является метод гибридизации нуклеиновых кислот. Вариации метода (гибридизация in situ - на месте) и FISH используются в тех случаях, когда имеются пробы, или зон­ды с известными (секвенированными) нуклеотидными последовательно­стями. Зонды - это искусственно синтезированные меченые: радиоактив­ными изотопами или флуоресцентными краси­телями - химически небольшие (10-30 нуклеогидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК), комплементарные ис­комому гену. Эти короткие олигонуклеотиды соединяются только с тем участком ДНК, который содержит последовательность нуклеотидов, стро­го соответствующую (комплементарную) последовательности нуклеотидов зонда. Следовательно, наличие связавшейся с ДНК метки с высокой точ­ностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых последовательностей нуклеотидов.

Локусы генов, комплементарные зондам, могут быть картированы непосредственно на хромосоме путем регистрации радиоактивной метки.

1.1.2. Хромосомный пейнтинг

Одним из наиболее разрешающих методов является многоцветная флуоресцентная гибридизация или хромосомный пейнтинг (хромосомная живопись). Для получения многоцветных изображений используют различные флуорохромы, которыми метят разные зонды ДНК. Информация об интенсивно­сти свечения каждого флуорохрома записывается на компьютере отдельно и каждому из таких изображений присваивается свой собственный псевдо­цвет.

1.1.3. Гибридизация соматических клеток

При цитологическом картировании используется также гибридизация соматических теток. В условиях культуры можно получить соматиче­ские гибриды клеток человека и различных грызунов: человек - мышь, че­ловек - крыса, человек - хомяк. Так, к 2002 году был полностью изучен геном мыши. Оказалось, что многие гены в геноме мыши гомологичны по структуре ге­нам человека.

1.2. Генетическое картирование

Генетические карты - это карты-схемы взаимного расположения генов на индивидуальных хромосомах, т.е. находящихся в одной группе сцепления.

Принципы генетического картирования были впервые разработаны Т. Морганом. Им же была составлена первая генетическая карта X-хромосомы дрозофилы, основанная на учете частоты образования кроссоверных и некроссоверных гамет у самок, гетерозиготных по рецессивным мутациям, локализованным в Х-хромосоме. Так. в мейозе гетерозиготных самок кроссинговер между генами у (желтое тело) и w- (белые глаза) про­исходил в 1,5% случаев, между генами w и m (миниатюрные крылья) -34,5%, а между генами у и т - 36% случаев.

Генетические карты сцепления правильно отражают порядок распо­ложения генов (или генетических маркеров) на хромосомах, однако рас­стояния между ними имеют относительные значения, т.е. не соответствуют реальным физическим расстояниям.

1.3 . Молекулярные маркеры ДНК и их использование для генетического картирования

1.3.1. ПДРФ - маркеры ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК,

Было установлено, что генетическим маркером может быть любое место в геноме, где произошло изменение в последовательности ДНК, которое обнаруживается как внут­реннее различие между индивидами в популяции, но никаких внешних (фенотипических; различий между ними при этом не наблюдается.

У бактерий установлен и выделен целый ряд ферментов рестриктаз, которые узнают специфические последовательности в молекуле ДНК (обычно составляющие 4-6 нуклеотидов) и разрезают двойную спираль внутри или вблизи сайта узнавания, в результате чего образуются рестрикционные фрагменты, или рестрикты.

Отсутствие сайта узнавания может быть связано с делецией. инсер-цией или заменой нуклеотидов. Следовательно, любая мутация, изменяю­щая последовательность нуклеотидов сайта рестрикции, уничтожает этот сайт.

1.3.2. Молекулярные маркеры, основанные на полимера гной цепной реакции (ПЦР-маркеры)

Принципы метода ПЦР. Полимеразная цепная реакция имитирует при­родный процесс воспроизведения (удвоения) ДНК - репликацию, проис­ходящую на матричной основе (по принципу комплементарности) с уча­стием фермента ДНК-полимеразы. Но если во время репликации удваива­ется вся ДНК, то при ПЦР - происходит многократное копирование (вос­произведение, амплификация) лишь интересующего исследователя специфического, небольшого фрагмента, расположенного между двумя праймерами.

1.3.3. Микросателлиты и минисателлиты как молекулярные маркеры

Разновидностями сатДНК являются.микросателлиты (МКС, или про­стые повторяющиеся последовательности - ППП) и минисателлиты (МНС). Минимальная повторяющаяся единица (КОР) микросателлитов включает от 1 до 10 пар нуклеотидов, минисателлитов - 15 -70 пн. Их рас­положение в геноме и число повторений коровых единиц специфичны для каждого организма.

1.4. Физическое картирование

Физическое картиро­вание основано на прямом анализе молекул ДНК. составляющих каждую хромосому (без анализа результатов скрещивания). Его конечная цель -определение последовательности нуклеотидов в каждой хромосоме

1.4.1. Создание рестрикционных карт

Рестрикционное картирование основано на установлении точек действия различных рестриктаз. Распределение сайтов рестрикции пред­ставляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и мо­жет использоваться для его идентификации.

Банк генов. Для этого фрагменты ДНК организма присоединяют к векторным молекулам, т.е. молекулам-переносчикам чужеродных генов. В качестве векторов используют плазмиды бактерий, фаги (вирусы, инфицирующие бактерии), космиды (гибридные молекулы, полученные из ДНК фага К и бактериальной плазмиды; благодаря наличию cos-участка фага А., который обеспечивает замыкание его линейной ДНК в кольцо, космидная ДНК, включившая чужеродные гены, может быть упакована в головку бакте­риофага). В качестве векторов используют также искусственные хромосо­мы дрожжей YAK - (ЯК) и бактерий ВАС - (БАК) хромосомы.

1.4.2. Создание упорядоченных библиотек клонов. Карты контиг.
Процедура "Прогулка по хромосоме"

Чтобы установить порядок расположения клонов (т.е. клонирован­ных фрагментов ДНК) на хромосоме (по ее длине), необходимо выявить участки их частичного перекрывания. Это можно сделать путем гибриди­зации нуклеиновых кислот, если известна нуклеотидная последователь­ность хотя бы одного фрагмента. Его метят радиоактивно или флуорохромом и используют в качестве зонда для создания упорядоченных библио­тек клонов.

"Прогулка по хромосоме" (скользящее зондирование). Для упоря­дочивания клонов используют две разные библиотеки геномной ДНК, по­лученные из ДНК одного и того же организма, но разделенные двумя раз­ными рестриктазами. Если один из генов (или клонов) в первой библиоте­ке удалось картировать и клонировать (т.е. получить из него ДНК-маркирующий сайт - STS), он затем может быть использован в качестве зонда для выявления перекрывающегося клона во второй библиотеке. А изученный клон второй библиотеки может использоваться как зонд для другого перекрывающегося фрагмента первой библиотеки и т.д.

Таким образом устанавливается порядок расположения клонов на хромосоме.

1.4. Определение нуклеотидной последовательности генома (секвенирование ) Исчерпывающая физическая карта генома человека (и любого друго­го организма) должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом.

1.5. Кандидатное картирование

В рамках этих подходов картировать ген означало пройти путь от его функции к локализации на хромосоме (позиции).